質保3年只換不修,廠家:長沙實了個驗儀器制造有限公司。
羅氏實時熒光定量PCR儀是一種用于核酸擴增及實時熒光檢測的高精密儀器。它結合了傳統(tǒng)PCR技術與熒光探針檢測技術,通過實時監(jiān)測PCR反應過程中熒光信號的變化,實現核酸的定量分析。本儀器具有靈敏度高、重復性好、反應速度快等特點,廣泛應用于臨床分子診斷、病原檢測、基因表達研究、藥物篩選及食品安全檢測等領域。
本實驗步驟旨在指導使用者正確操作羅氏實時熒光定量PCR儀,從樣品準備、反應體系配置到數據分析與結果判讀,確保實驗結果的準確性與可重復性。
室溫應保持在18℃~30℃之間,相對濕度30%~80%。
環(huán)境應清潔、無塵、無強光照射。
避免電磁干擾及震動,儀器需放置在平穩(wěn)工作臺上。
實驗室應設有獨立的核酸提取區(qū)、擴增反應配置區(qū)與產物分析區(qū),以防交叉污染。
羅氏實時熒光定量PCR儀主機一臺。
專用光學反應管或96孔反應板。
熒光定量PCR專用試劑盒。
微量移液器及無RNA酶吸頭。
冷卻架、離心機、漩渦混合器等輔助設備。
配套計算機及數據分析軟件。
PCR反應混合液(Master Mix)。
正向、反向引物及熒光探針。
模板核酸(DNA或RNA,經反轉錄生成cDNA)。
無核酸酶水(ddH?O)作為陰性對照。
陽性標準品用于系統(tǒng)驗證。
按樣品類型提取核酸。常見方法包括離心柱法、磁珠法或自動提取系統(tǒng)。
用分光光度計檢測核酸濃度與純度,確保A260/A280值在1.8~2.0之間。
根據實驗設計,將提取的核酸稀釋至適當濃度備用。
所有樣品在操作過程中應防止RNA/DNA降解,避免反復凍融。
每個PCR反應體系常為20 μL或25 μL,典型配方如下(僅供參考):
| 組分 | 體積(μL) | 備注 |
|---|---|---|
| Master Mix | 10.0 | 含緩沖液、dNTPs、Taq酶 |
| 上游引物(10 μM) | 0.5 | 特異性設計 |
| 下游引物(10 μM) | 0.5 | 特異性設計 |
| 探針(10 μM) | 0.5 | 熒光標記探針 |
| 模板核酸 | 2.0 | 根據實驗濃度調整 |
| 無核酸酶水 | 6.5 | 調整總體積 |
配置時需在低溫條件下完成,混合均勻后輕輕離心,確保液體集中于管底。
將反應體系分別加入PCR管或96孔反應板中。
用光學封板膜密封,防止蒸發(fā)或交叉污染。
使用離心機短暫離心,使液體沉至孔底并排出氣泡。
樣品順序及位置應與軟件輸入相一致,以便后期數據對應。
打開羅氏實時熒光定量PCR儀,預熱系統(tǒng)。
在軟件中創(chuàng)建新實驗項目,輸入樣品信息、孔位布局及反應類型。
設定溫控程序:
變性:95℃,10秒
退火/延伸:60℃,30秒(采集熒光信號)
初始變性:95℃,3分鐘
擴增循環(huán)(40次):
選擇合適的熒光檢測通道(如FAM、HEX、ROX等),根據探針類型匹配濾光片。
保存設定并啟動實驗。
儀器運行期間,系統(tǒng)自動采集熒光信號??赏ㄟ^軟件實時觀察擴增曲線的上升情況。若出現異常波動,可暫停檢查樣品或反應體系是否存在問題。
整個擴增過程約需1~1.5小時,具體時間取決于反應體系與升降溫速率。
擴增曲線分析
軟件自動繪制每個樣品的熒光擴增曲線。有效擴增曲線應呈S形,基線階段平穩(wěn),指數階段上升明顯,平臺期穩(wěn)定。
閾值與Ct值設定
由系統(tǒng)根據基線信號自動計算閾值,或手動設置。Ct(Cycle threshold)值為熒光信號超過閾值時的循環(huán)數,是定量分析的關鍵參數。
標準曲線建立
若為絕對定量實驗,應輸入系列稀釋標準品濃度,軟件將自動生成標準曲線(Ct值對數線性關系),并計算樣品中目標基因的拷貝數。
相對定量分析
對于基因表達研究,通常以內參基因(如β-actin、GAPDH)為對照,計算ΔCt、ΔΔCt及表達倍數變化。
熔解曲線分析
若使用SYBR Green染料體系,應進行熔解曲線分析,以判斷擴增產物特異性。單一峰值代表特異性擴增,多個峰值提示引物二聚體或非特異性擴增。
陽性樣品:Ct值在設定閾值范圍內且擴增曲線正常。
陰性樣品:未檢測到有效熒光信號,Ct值>40或無擴增曲線。
可疑結果:Ct值接近閾值邊界(如37~40),應重復檢測確認。
對照結果:陽性對照應有典型曲線,陰性對照無信號,否則實驗無效。
最終結果可導出Excel或PDF格式,并生成檢測報告。報告中應包含樣品編號、Ct值、標準曲線、熔解曲線及定量結果。
| 問題現象 | 可能原因 | 處理方法 |
|---|---|---|
| Ct值偏高 | 模板濃度低或酶活下降 | 檢測模板純度或更換試劑 |
| 無擴增曲線 | 通道設置錯誤 | 檢查探針與通道匹配 |
| 擴增曲線不平滑 | 氣泡或反應不均勻 | 離心樣品后重新上機 |
| 熔解曲線多峰 | 引物二聚體 | 優(yōu)化引物設計或退火溫度 |
| 曲線漂移 | 燈源老化或光路污染 | 清潔光學系統(tǒng)或聯(lián)系廠家維護 |
實驗中需全程佩戴防護手套,避免污染。
不同樣品及試劑操作應使用獨立吸頭。
所有反應體系應在冰上配制,防止酶提前反應。
使用后及時清潔樣品臺面及儀器外殼。
定期更新儀器軟件版本以保持功能兼容性。
若儀器長期未使用,應定期通電自檢,保持系統(tǒng)穩(wěn)定。
實驗結束后,用干凈軟布擦拭儀器表面及樣品倉。
禁止使用酒精或腐蝕性液體清潔光學組件。
定期校準溫度及光學系統(tǒng),每6個月建議由廠家技術工程師進行全面檢修。
若儀器出現異常噪音或溫控失衡,應立即停止使用并聯(lián)系售后服務。
羅氏實時熒光定量PCR儀由長沙實了個驗儀器制造有限公司制造,享有質保3年,只換不修的服務政策。在質保期內,如出現非人為故障,廠家將免費更換整機或主要部件。售后服務包括安裝調試、用戶培訓、軟件升級、遠程技術支持及上門維護,確保用戶長期穩(wěn)定使用。
羅氏實時熒光定量PCR儀以精準的溫控系統(tǒng)、靈敏的光學檢測、智能化的軟件分析和優(yōu)越的穩(wěn)定性能,為科研和臨床檢測提供了可靠的技術平臺。嚴格遵循實驗步驟與維護規(guī)范,不僅能保證數據的準確性與重復性,還能延長儀器使用壽命。配合廠家提供的三年更換保障政策,用戶可在核酸檢測與分子生物學研究中獲得更高效率與更強信心。
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