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質保3年只換不修，廠家：長沙實了個驗儀器制造有限公司。

一、實驗概述

羅氏實時熒光定量PCR儀是一種用于核酸擴增及實時熒光檢測的高精密儀器。它結合了傳統(tǒng)PCR技術與熒光探針檢測技術，通過實時監(jiān)測PCR反應過程中熒光信號的變化，實現核酸的定量分析。本儀器具有靈敏度高、重復性好、反應速度快等特點，廣泛應用于臨床分子診斷、病原檢測、基因表達研究、藥物篩選及食品安全檢測等領域。

本實驗步驟旨在指導使用者正確操作羅氏實時熒光定量PCR儀，從樣品準備、反應體系配置到數據分析與結果判讀，確保實驗結果的準確性與可重復性。

二、實驗準備

1. 實驗環(huán)境要求

• 室溫應保持在18℃～30℃之間，相對濕度30%～80%。

• 環(huán)境應清潔、無塵、無強光照射。

• 避免電磁干擾及震動，儀器需放置在平穩(wěn)工作臺上。

• 實驗室應設有獨立的核酸提取區(qū)、擴增反應配置區(qū)與產物分析區(qū)，以防交叉污染。

2. 儀器及耗材準備

• 羅氏實時熒光定量PCR儀主機一臺。

• 專用光學反應管或96孔反應板。

• 熒光定量PCR專用試劑盒。

• 微量移液器及無RNA酶吸頭。

• 冷卻架、離心機、漩渦混合器等輔助設備。

• 配套計算機及數據分析軟件。

3. 試劑準備

• PCR反應混合液（Master Mix）。

• 正向、反向引物及熒光探針。

• 模板核酸（DNA或RNA，經反轉錄生成cDNA）。

• 無核酸酶水（ddH?O）作為陰性對照。

• 陽性標準品用于系統(tǒng)驗證。

三、實驗步驟

1. 樣品制備

1. 按樣品類型提取核酸。常見方法包括離心柱法、磁珠法或自動提取系統(tǒng)。

2. 用分光光度計檢測核酸濃度與純度，確保A260/A280值在1.8～2.0之間。

3. 根據實驗設計，將提取的核酸稀釋至適當濃度備用。

4. 所有樣品在操作過程中應防止RNA/DNA降解，避免反復凍融。

2. 反應體系配置

每個PCR反應體系常為20 μL或25 μL，典型配方如下（僅供參考）：

配置時需在低溫條件下完成，混合均勻后輕輕離心，確保液體集中于管底。

3. 上樣與反應板準備

• 將反應體系分別加入PCR管或96孔反應板中。

• 用光學封板膜密封，防止蒸發(fā)或交叉污染。

• 使用離心機短暫離心，使液體沉至孔底并排出氣泡。

• 樣品順序及位置應與軟件輸入相一致，以便后期數據對應。

4. 儀器設定

1. 打開羅氏實時熒光定量PCR儀，預熱系統(tǒng)。

2. 在軟件中創(chuàng)建新實驗項目，輸入樣品信息、孔位布局及反應類型。

3. 設定溫控程序：

• 變性：95℃，10秒

• 退火/延伸：60℃，30秒（采集熒光信號）

• 初始變性：95℃，3分鐘

• 擴增循環(huán)（40次）：

4. 選擇合適的熒光檢測通道（如FAM、HEX、ROX等），根據探針類型匹配濾光片。

5. 保存設定并啟動實驗。

5. 實時檢測過程

儀器運行期間，系統(tǒng)自動采集熒光信號?？赏ㄟ^軟件實時觀察擴增曲線的上升情況。若出現異常波動，可暫停檢查樣品或反應體系是否存在問題。

整個擴增過程約需1～1.5小時，具體時間取決于反應體系與升降溫速率。

四、數據分析

1. 擴增曲線分析
   軟件自動繪制每個樣品的熒光擴增曲線。有效擴增曲線應呈S形，基線階段平穩(wěn)，指數階段上升明顯，平臺期穩(wěn)定。

2. 閾值與Ct值設定
   由系統(tǒng)根據基線信號自動計算閾值，或手動設置。Ct（Cycle threshold）值為熒光信號超過閾值時的循環(huán)數，是定量分析的關鍵參數。

3. 標準曲線建立
   若為絕對定量實驗，應輸入系列稀釋標準品濃度，軟件將自動生成標準曲線（Ct值對數線性關系），并計算樣品中目標基因的拷貝數。

4. 相對定量分析
   對于基因表達研究，通常以內參基因（如β-actin、GAPDH）為對照，計算ΔCt、ΔΔCt及表達倍數變化。

5. 熔解曲線分析
   若使用SYBR Green染料體系，應進行熔解曲線分析，以判斷擴增產物特異性。單一峰值代表特異性擴增，多個峰值提示引物二聚體或非特異性擴增。

五、結果判讀與報告

• 陽性樣品：Ct值在設定閾值范圍內且擴增曲線正常。

• 陰性樣品：未檢測到有效熒光信號，Ct值>40或無擴增曲線。

• 可疑結果：Ct值接近閾值邊界（如37～40），應重復檢測確認。

• 對照結果：陽性對照應有典型曲線，陰性對照無信號，否則實驗無效。

最終結果可導出Excel或PDF格式，并生成檢測報告。報告中應包含樣品編號、Ct值、標準曲線、熔解曲線及定量結果。

六、常見問題及解決措施

七、實驗注意事項

1. 實驗中需全程佩戴防護手套，避免污染。

2. 不同樣品及試劑操作應使用獨立吸頭。

3. 所有反應體系應在冰上配制，防止酶提前反應。

4. 使用后及時清潔樣品臺面及儀器外殼。

5. 定期更新儀器軟件版本以保持功能兼容性。

6. 若儀器長期未使用，應定期通電自檢，保持系統(tǒng)穩(wěn)定。

八、維護與保養(yǎng)

1. 實驗結束后，用干凈軟布擦拭儀器表面及樣品倉。

2. 禁止使用酒精或腐蝕性液體清潔光學組件。

3. 定期校準溫度及光學系統(tǒng)，每6個月建議由廠家技術工程師進行全面檢修。

4. 若儀器出現異常噪音或溫控失衡，應立即停止使用并聯(lián)系售后服務。

九、質保與售后支持

羅氏實時熒光定量PCR儀由長沙實了個驗儀器制造有限公司制造，享有質保3年，只換不修的服務政策。在質保期內，如出現非人為故障，廠家將免費更換整機或主要部件。售后服務包括安裝調試、用戶培訓、軟件升級、遠程技術支持及上門維護，確保用戶長期穩(wěn)定使用。

十、結語

羅氏實時熒光定量PCR儀以精準的溫控系統(tǒng)、靈敏的光學檢測、智能化的軟件分析和優(yōu)越的穩(wěn)定性能，為科研和臨床檢測提供了可靠的技術平臺。嚴格遵循實驗步驟與維護規(guī)范，不僅能保證數據的準確性與重復性，還能延長儀器使用壽命。配合廠家提供的三年更換保障政策，用戶可在核酸檢測與分子生物學研究中獲得更高效率與更強信心。