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質(zhì)保3年只換不修，廠家長沙實了個驗儀器制造有限公司

一、設(shè)備與樣品概述

伯樂（Bio-Rad）電穿孔儀165-2660是一款高精度的電轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、基因工程、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和基因編輯實驗。該設(shè)備通過瞬時高壓脈沖在細(xì)胞膜上形成可逆性微孔，使外源DNA、RNA或蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。
在整個實驗體系中，樣品的質(zhì)量與處理方式是影響電穿孔效果的核心要素之一。即使儀器性能再優(yōu)異，若樣品不符合電轉(zhuǎn)化要求，也會導(dǎo)致低轉(zhuǎn)化效率或細(xì)胞死亡率升高。因此，在正式操作前，樣品的準(zhǔn)備與質(zhì)量控制至關(guān)重要。

伯樂165-2660的設(shè)計允許在廣泛的樣品類型下使用，包括細(xì)菌、酵母、植物原生質(zhì)體、哺乳動物細(xì)胞、干細(xì)胞以及原代組織細(xì)胞。不同類型樣品的物理特性、導(dǎo)電性及生理狀態(tài)差異較大，需依據(jù)各自特征制定相應(yīng)的預(yù)處理方案。

二、樣品的基本要求

1. 細(xì)胞活性要求

電穿孔實驗要求細(xì)胞處于高活性、對數(shù)生長期或生理穩(wěn)定狀態(tài)。

• 對于細(xì)菌和酵母，需確保處于指數(shù)生長期，OD600值一般在0.5–0.8之間；

• 對于真核細(xì)胞，應(yīng)選擇處于生長旺盛、貼壁良好、形態(tài)均一的群體；

• 原代細(xì)胞或干細(xì)胞實驗需避免細(xì)胞過度分化或凋亡。

細(xì)胞活性直接影響膜恢復(fù)能力與電穿孔后復(fù)蘇效率。若樣品活性下降，將導(dǎo)致電場作用下膜損傷不可逆，實驗失敗率增加。

2. 樣品純度要求

電穿孔過程中電流需通過樣品液體形成穩(wěn)定電場，因此樣品純度必須高。
污染的離子、蛋白、雜質(zhì)會改變導(dǎo)電性并導(dǎo)致電弧放電。

• 所有細(xì)胞懸液應(yīng)使用無離子緩沖液洗滌2–3次；

• DNA、RNA樣品需純度高、無蛋白或有機溶劑殘留；

• 若使用商業(yè)提取試劑，應(yīng)在最后步驟徹底去除鹽分。

純度不足的樣品容易產(chǎn)生“電弧效應(yīng)”，不僅損壞電極，也使細(xì)胞全部死亡。

3. 樣品濃度要求

適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度有助于形成均勻的電場環(huán)境。濃度過高會造成電阻降低、放電不均；濃度過低則導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率不足。
一般推薦濃度如下：

DNA或RNA加入量通?？刂圃跇悠敷w積的1–10%范圍內(nèi)，濃度建議為10–100 ng/μL。過高濃度會導(dǎo)致黏度增加、局部電場分布不均。

三、緩沖液及離子環(huán)境要求

1. 緩沖液導(dǎo)電性

電穿孔要求液體導(dǎo)電性低，以防止能量被離子消耗或引發(fā)電弧。伯樂建議使用專用的無離子電穿孔緩沖液。常用溶液包括：

• 無鹽HEPES緩沖液；

• 無離子甘露醇緩沖液；

• 低離子含量PBS衍生液（需特別去除NaCl）。

導(dǎo)電性理想值應(yīng)低于 5 μS/cm。若使用水或普通生理鹽水，極易導(dǎo)致高電流和熱損傷。

2. pH與滲透壓

電穿孔過程中，細(xì)胞膜短暫暴露在高電場下，若溶液pH或滲透壓異常，會加劇細(xì)胞應(yīng)激。

• pH應(yīng)維持在7.0–7.4范圍；

• 滲透壓需接近細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，尤其是原生質(zhì)體與動物細(xì)胞，應(yīng)添加等滲組分（如250 mM蔗糖或甘露醇）。

高滲或低滲環(huán)境均可能導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)異常，降低膜修復(fù)能力。

3. 緩沖液溫度

低溫有助于減少電穿孔過程中熱效應(yīng)。實驗前所有緩沖液應(yīng)預(yù)冷至 4°C 左右，但不得凍結(jié)。溫度過低會增加液體電阻，而溫度過高會導(dǎo)致膜不可逆破裂。

四、DNA與RNA樣品要求

1. 純度與濃度

核酸樣品應(yīng)具備較高純度，A260/A280比值在1.8–2.0之間。任何鹽離子、乙醇、酚或蛋白殘留都會干擾放電波形。
若使用乙醇沉淀純化的DNA，需徹底干燥殘留乙醇后再溶于無鹽緩沖液中。

濃度建議：

• 質(zhì)粒DNA：10–100 ng/μL；

• 線性DNA：20–200 ng/μL；

• mRNA：0.1–1 μg/μL。

2. 分子大小

質(zhì)粒或線性DNA分子越大，進(jìn)入細(xì)胞所需電場強度越高。一般情況下，小質(zhì)粒（<10 kb）電壓1.5–2.0 kV即可，而大分子載體可能需略高電壓或延長脈沖時間。
對于RNA類樣品，應(yīng)避免長時間暴露空氣，實驗全程保持無RNA酶環(huán)境。

3. 緩沖體系相容性

DNA或RNA應(yīng)溶解于與細(xì)胞懸液成分相容的緩沖體系中，避免離子濃度差異導(dǎo)致局部電壓集中。常用溶劑包括無鹽Tris、TE（低離子型）或超純水。

五、不同樣品類型的具體要求

1. 細(xì)菌樣品

• 應(yīng)選用新鮮培養(yǎng)、無污染的菌株；

• 在冰浴條件下洗滌，使用低導(dǎo)電性溶液（10%甘油或無鹽Tris）；

• 質(zhì)粒加入量控制在樣品體積的1–2%；

• 電轉(zhuǎn)杯需充分預(yù)冷，避免局部過熱。

若出現(xiàn)放電火花，說明樣品鹽分過高，應(yīng)重新洗滌。

2. 酵母與真菌樣品

酵母細(xì)胞壁較厚，需提前酶解或化學(xué)預(yù)處理以增強膜通透性。常用方法包括β-葡聚糖酶處理或短暫高溫沖擊。
電穿孔時建議使用含蔗糖或山梨醇的滲透緩沖液，保證細(xì)胞不因滲透壓差破裂。
樣品溫度應(yīng)保持在0–4°C，減少熱應(yīng)激。

3. 哺乳動物細(xì)胞

哺乳動物細(xì)胞對電場極為敏感，要求：

• 懸浮狀態(tài)均一，無團聚；

• 緩沖液無鈣鎂離子，導(dǎo)電性低；

• 樣品體積一般為50–100 μL；

• DNA質(zhì)量高，避免載體內(nèi)內(nèi)毒素殘留。

放電結(jié)束后，應(yīng)立即轉(zhuǎn)入含血清培養(yǎng)基中復(fù)蘇，以促進(jìn)膜修復(fù)。

4. 植物原生質(zhì)體

植物原生質(zhì)體需通過酶解法制備，確保細(xì)胞壁完全去除。

• 懸浮介質(zhì)含0.5 M甘露醇或蔗糖，維持等滲；

• 電轉(zhuǎn)樣品應(yīng)避免氣泡形成；

• 電壓0.6–1.0 kV，電容1000 μF，放電時間10 ms左右；

• 放電后立即在低溫等滲液中靜置數(shù)小時以恢復(fù)膜完整性。

5. 干細(xì)胞與免疫細(xì)胞

此類細(xì)胞結(jié)構(gòu)脆弱，應(yīng)嚴(yán)格控制電壓與時間常數(shù)。
樣品需新鮮分離，避免離心過度；
緩沖液可使用專用電穿孔緩沖體系，維持滲透壓與細(xì)胞活性。
RNA或RNP導(dǎo)入實驗中應(yīng)全程無RNA酶操作，并在冰上快速進(jìn)行。

六、樣品體積與電轉(zhuǎn)杯要求

1. 體積控制

電轉(zhuǎn)杯體積決定電場分布。伯樂165-2660兼容多種電轉(zhuǎn)杯規(guī)格，常用為0.1 cm、0.2 cm和0.4 cm間隙。

液體體積過多易產(chǎn)生電流不均，過少則易形成氣泡導(dǎo)致電弧。液面應(yīng)平整且無氣泡，操作時可輕輕敲擊杯壁排氣。

2. 電極清潔與杯體狀態(tài)

電極若附著鹽分或蛋白，會增加局部電阻，產(chǎn)生放電異常。實驗前應(yīng)使用無離子水或70%乙醇清洗杯體，并自然晾干。
杯體表面需保持完好、無劃痕，以防電流集中造成電弧。

七、樣品溫度與環(huán)境控制

溫度直接影響液體電阻與細(xì)胞膜穩(wěn)定性。

• 推薦操作溫度為0–4°C；

• 樣品應(yīng)全程置于冰上，但不得凍結(jié)；

• 高溫會加快膜破裂并降低存活率。

實驗結(jié)束后，應(yīng)立即將樣品移入預(yù)溫培養(yǎng)基中復(fù)蘇，避免因溫差導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激。

八、實驗前準(zhǔn)備與檢測

1. 樣品檢測：
   在正式電穿孔前，可取少量樣品檢測電導(dǎo)率，理想值為4–6 μS/cm。若過高，應(yīng)繼續(xù)洗滌。

2. 氣泡檢查：
   樣品裝入電轉(zhuǎn)杯后，仔細(xì)觀察是否有氣泡。氣泡是導(dǎo)致放電失敗的主要原因之一。

3. 濃度確認(rèn)：
   若細(xì)胞過于密集，可適度稀釋。對于高密度樣品，需避免形成聚團。

4. 質(zhì)粒測試：
   在大規(guī)模轉(zhuǎn)化前，應(yīng)以小樣測試質(zhì)粒質(zhì)量與濃度，確定最優(yōu)條件。

九、樣品穩(wěn)定性與存儲

實驗用樣品應(yīng)現(xiàn)制現(xiàn)用，不建議長時間儲存。若確需保存：

• 細(xì)胞懸液可在4°C短期存放，不超過2小時；

• DNA、RNA樣品可置于-20°C長期保存，但使用前需緩慢解凍并保持無菌環(huán)境；

• 電轉(zhuǎn)杯不得重復(fù)使用污染樣品，避免交叉反應(yīng)。

十、常見問題與解決方案

十一、樣品優(yōu)化策略

伯樂165-2660具備高精度電壓與電容控制系統(tǒng)，允許實驗者針對不同樣品進(jìn)行細(xì)致優(yōu)化。優(yōu)化過程可分為以下步驟：

1. 從較低電壓開始逐步提高，觀察時間常數(shù)變化；

2. 調(diào)整細(xì)胞濃度與DNA比例；

3. 記錄每次實驗的溫度、時間常數(shù)與復(fù)蘇結(jié)果；

4. 通過統(tǒng)計分析確定最優(yōu)條件。

建立樣品數(shù)據(jù)庫后，后續(xù)實驗可快速調(diào)用參數(shù)，提高效率與重復(fù)性。