伯樂(Bio-Rad)電穿孔儀165-2661是高精度電轉(zhuǎn)化儀器,廣泛應用于基因工程、分子生物學、細胞轉(zhuǎn)染及蛋白表達研究。
該設備通過高壓脈沖電場作用于細胞,使細胞膜形成瞬時可逆性孔洞,從而使外源DNA、RNA或蛋白質(zhì)分子進入細胞內(nèi)部。
正確掌握165-2661的操作要點,是確保實驗成功、提高轉(zhuǎn)化效率并延長設備使用壽命的關鍵。
本篇文檔系統(tǒng)闡述伯樂165-2661在操作過程中的核心要點、注意事項、參數(shù)調(diào)整、常見問題及安全規(guī)范,為科研人員提供一份詳盡的技術參考。
電穿孔技術的核心在于瞬時能量釋放,使細胞膜電勢升高并突破膜電阻形成孔洞。
165-2661通過內(nèi)置高壓電源和多檔電容控制電場強度與作用時間,達到精準控制穿孔效果的目的。
基本工作原理包括以下過程:
充電階段:系統(tǒng)為電容充電至設定電壓;
放電階段:按下放電鍵后,能量通過電極釋放至樣品;
電場作用:細胞膜發(fā)生電擊孔化;
恢復階段:膜孔關閉,外源分子被細胞吸收。
能量釋放過程符合指數(shù)衰減模型:
Vt=V0e?t/RCV_t = V_0 e^{-t/RC}Vt=V0e?t/RC
其中,V?為初始電壓,R為樣品電阻,C為電容。時間常數(shù)τ=RC決定放電持續(xù)時間,是實驗優(yōu)化的關鍵參數(shù)。
室溫保持在20–25°C,濕度≤60%;
實驗臺應干燥、平穩(wěn)、無金屬導電物;
設備周圍應留有30 cm散熱空間;
避免強磁場、電源波動及靜電干擾。
使用AC 220V ±10%,50/60 Hz電源;
確認接地良好,接地電阻≤1 Ω;
禁止與加熱器或離心機共用插座。
開啟電源后,設備會自動執(zhí)行系統(tǒng)檢測,確認以下項目:
電壓模塊正常;
電容充放電狀態(tài)良好;
安全蓋感應系統(tǒng)工作正常;
顯示屏顯示“Ready to Pulse”代表設備可用。
若顯示錯誤代碼(如“ARC ERROR”或“GND ERROR”),應停止使用并排查問題。
使用對數(shù)生長期細胞;
細胞濃度一般為10? cells/mL(細菌)或10? cells/mL(哺乳細胞);
細胞應活力良好,無污染或死亡現(xiàn)象。
電導率需控制在5–10 μS/cm;
推薦使用10%甘油、HEPES緩沖液或低離子溶液;
禁止使用含NaCl、PBS或培養(yǎng)基等高鹽體系。
DNA純度(A260/A280)應在1.8–2.0之間;
質(zhì)粒濃度建議為20–50 ng/μL;
混合均勻后置冰上待用。
選用0.1、0.2或0.4 cm間隙的電轉(zhuǎn)杯;
使用前用70%乙醇清洗并自然晾干;
樣品體積占電轉(zhuǎn)杯容積的80%,避免氣泡產(chǎn)生;
操作全程在冰上進行。
通過按鍵“VOLTAGE”設定,范圍0.2–2.5 kV,步進精度0.01 kV。
建議電壓設定依據(jù)實驗體系如下:
| 實驗體系 | 電壓范圍(kV) | 推薦值 |
|---|---|---|
| E. coli | 2.0–2.5 | 2.5 |
| 酵母 | 1.0–1.5 | 1.2 |
| 哺乳動物細胞 | 0.25–0.8 | 0.5 |
| 植物原生質(zhì)體 | 0.8–1.0 | 0.9 |
通過“CAP”鍵選擇電容檔位,范圍25–3300 μF。
不同體系推薦如下:
| 實驗體系 | 電容(μF) | 時間常數(shù)(ms) |
|---|---|---|
| 細菌 | 25 | 4–5 |
| 酵母 | 50 | 8–10 |
| 哺乳動物細胞 | 250 | 15–25 |
| 植物原生質(zhì)體 | 500 | 20–30 |
按“MODE”鍵選擇放電模式:
SINGLE PULSE:適用于細菌、酵母;
MULTI PULSE:適用于哺乳動物細胞;
PROGRAM MODE:調(diào)用已保存參數(shù)方案。
按“ENTER”鍵確認設置,LCD顯示:
vbnet復制編輯VOLTAGE: 2.50kVCAP: 25μF
READY TO PULSE
此時系統(tǒng)準備完畢,可進行放電操作。
將裝有樣品的電轉(zhuǎn)杯置入電極槽;
關閉安全蓋,確保蓋體磁感應系統(tǒng)鎖定;
按下“PULSE”鍵,系統(tǒng)充電并自動放電;
放電后屏幕顯示時間常數(shù)(τ)和狀態(tài);
若顯示“ARC DETECTED”,需重新制備樣品;
待屏幕恢復“READY”狀態(tài)后方可進行下一次放電。
典型放電顯示示例:
vbnet復制編輯VOLTAGE: 2.50kV
TIME CONST: 4.9msARC: NONE
COMPLETE
此時說明放電順利完成。
放電完成后,立即取出電轉(zhuǎn)杯并置于冰上;
用無菌移液器吸取樣品,轉(zhuǎn)入1 mL冰冷SOC或培養(yǎng)基中;
復蘇時間一般為45–60分鐘(37°C,200 rpm搖床);
隨后進行平板涂布或細胞培養(yǎng)。
復蘇時間過短可能影響外源DNA整合,過長則增加代謝負擔。
放電后記錄τ值(時間常數(shù)),應接近預設值。
若偏差>±0.3 ms,說明樣品導電性異常或電極接觸不良。
若顯示“ARC DETECTED”,應:
檢查樣品是否含鹽;
檢查是否存在氣泡;
清潔電極并重新預冷。
根據(jù)菌落計數(shù)或熒光檢測計算轉(zhuǎn)化效率。
例如:
E=NC×DE = \frac{N}{C × D}E=C×DN
其中E為轉(zhuǎn)化效率(CFU/μg DNA),N為克隆數(shù),C為DNA用量,D為稀釋倍數(shù)。
高效電擊條件下,E. coli 轉(zhuǎn)化效率可達 3×10? CFU/μg DNA。
嚴禁在設備通電狀態(tài)下觸碰電極或樣品;
操作時需佩戴絕緣手套;
若出現(xiàn)異常聲響或氣味,應立即切斷電源;
每次實驗結束后,等待5秒再取出電轉(zhuǎn)杯;
放電后務必執(zhí)行自動放電功能,以釋放殘余能量。
設備安全系統(tǒng)包括:
蓋體聯(lián)鎖防護;
自動放電電路;
電弧檢測保護;
接地電阻監(jiān)控系統(tǒng)。
日常維護
每次使用后,用無水乙醇清潔電極槽;
檢查電極無氧化或腐蝕;
定期檢查電源線和插頭是否牢固。
月度維護
測試電壓輸出精度(允許偏差±1%);
清潔風扇與通風口,保持散熱通暢;
校驗時間常數(shù)顯示精度。
年度校準
使用高壓表檢測輸出電壓;
測試電容實際容量并記錄衰減率;
校準后由技術人員貼上合格標識。
| 問題現(xiàn)象 | 可能原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| 無放電反應 | 安全蓋未閉合 | 檢查蓋體磁感應系統(tǒng) |
| 屏幕閃爍 | 電源電壓不穩(wěn) | 使用穩(wěn)壓電源 |
| ARC DETECTED | 樣品含鹽或氣泡 | 重新制備樣品 |
| TIME CONST=0 | 電極接觸不良 | 清潔并重新安裝電轉(zhuǎn)杯 |
| 放電延遲 | 電容未完全充電 | 等待“Ready”提示后再放電 |
| 噪音大 | 風扇積塵 | 清潔風口并檢查散熱系統(tǒng) |
優(yōu)化能量匹配
調(diào)整電壓與電容組合,確保時間常數(shù)在目標范圍。
保持低離子環(huán)境
緩沖液純度直接影響電場穩(wěn)定性。
嚴格溫控管理
樣品溫度過高會加速細胞破裂,應始終保持在4°C。
記錄與追蹤
每次實驗記錄電壓、時間常數(shù)、ARC狀態(tài)和轉(zhuǎn)化效率,建立設備運行檔案。
伯樂165-2661具備數(shù)據(jù)存儲與導出功能,可自動保存1000組實驗數(shù)據(jù)。
數(shù)據(jù)內(nèi)容包括:
放電日期與時間;
設定電壓與電容;
實際τ值與電弧狀態(tài);
操作者編號。
通過USB導出后可生成CSV文件,用于統(tǒng)計分析或參數(shù)追蹤。
根據(jù)連續(xù)實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計:
時間常數(shù)偏差≤±0.2 ms;
電壓輸出誤差≤±1%;
放電重復性誤差CV≤2%;
轉(zhuǎn)化效率波動范圍≤10%。
說明在標準化操作條件下,165-2661具有高度穩(wěn)定性與可重復性。
| 分類 | 操作要點 | 說明 |
|---|---|---|
| 實驗準備 | 樣品預冷、低離子緩沖液 | 提高存活率 |
| 參數(shù)設置 | 精確設定電壓與電容 | 控制能量釋放 |
| 放電執(zhí)行 | 關閉安全蓋、確保接地 | 避免電弧與觸電 |
| 放電后處理 | 立即復蘇、冰浴冷卻 | 防止細胞損傷 |
| 數(shù)據(jù)管理 | 記錄τ值與轉(zhuǎn)化結果 | 提高可追溯性 |
| 安全維護 | 定期清潔與校準 | 保證長期性能穩(wěn)定 |
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