電穿孔技術是一種高效、可控且廣泛應用的外源分子導入方法,能夠在不依賴化學轉(zhuǎn)染試劑的條件下,將 DNA、RNA 或蛋白質(zhì)導入細胞內(nèi)部。其核心原理是利用瞬時高電場在細胞膜上產(chǎn)生可逆性孔洞,使外源分子進入細胞,再通過細胞膜自我修復機制恢復完整性。
伯樂(Bio-Rad)GenePulser Xcell 電穿孔儀作為業(yè)內(nèi)廣泛使用的專業(yè)設備,具備精確的參數(shù)控制、兩種放電模式(指數(shù)衰減波與方波)、高重復性及完善的安全保護系統(tǒng)。該儀器可適用于細菌、酵母、植物原生質(zhì)體及哺乳動物細胞等多種類型實驗。
本文將系統(tǒng)介紹 GenePulser Xcell 的實驗方案設計,包括實驗原理、設備組成、前期準備、標準操作流程、不同細胞類型方案、參數(shù)優(yōu)化、結(jié)果分析及注意事項,幫助科研人員實現(xiàn)高效率、可重復的電穿孔實驗。
電穿孔實驗主要依賴瞬間高電場作用。當電壓施加于細胞懸液時,細胞膜兩側(cè)形成電勢差。當膜電位超過某一閾值(約 0.5–1 V),膜脂雙層結(jié)構局部重排,產(chǎn)生納米級通道。此時外源分子得以通過這些孔進入細胞內(nèi)。電場撤除后,膜通道逐漸關閉,細胞重新恢復完整性。
影響電穿孔效果的主要因素包括:
電場強度(電壓與電極間距);
脈沖持續(xù)時間;
緩沖液導電性;
樣品溫度;
細胞狀態(tài)與密度。
GenePulser Xcell 通過精準控制這些參數(shù),實現(xiàn)不同細胞類型的最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件。
主機與控制系統(tǒng):內(nèi)置高精度微處理控制芯片,負責參數(shù)設定、波形輸出與安全監(jiān)控。
波形模塊:支持指數(shù)衰減波(Exponential Decay)和方波(Square Wave)兩種放電形式。
電容與電阻單元:用于調(diào)節(jié)放電能量與電流時間常數(shù)。
電極槽與電穿孔杯接口:保證電場均勻分布并防止電弧。
顯示與操作面板:可實時查看電壓、電容、脈沖時間及輸出曲線。
數(shù)據(jù)存儲系統(tǒng):可保存實驗方案,便于重復操作與質(zhì)量追溯。
安全模塊:包括自動放電、防電擊及過載保護功能。
確認電源接地良好;
檢查電極槽干凈、無鹽分殘留;
開機自檢后顯示系統(tǒng)正常;
使用原廠電穿孔杯(間距 0.2 cm 或 0.4 cm)。
細胞處于對數(shù)生長期,活力高;
DNA/RNA 純度高,無鹽離子或蛋白污染;
緩沖液為低離子強度溶液,如 10% 甘油或?qū)S秒姶┛拙彌_液;
樣品中禁止存在氣泡,防止電弧放電。
室溫 20–25℃;
濕度 40–60%;
實驗臺及操作者佩戴絕緣手套。
打開電源,進入主界面;
選擇實驗模式(指數(shù)衰減或方波);
根據(jù)細胞類型設置電壓、電容、電阻或脈沖時間;
保存設定方案;
進行一次空載放電測試,確認波形正常。
將細胞懸液與待轉(zhuǎn)染的 DNA/RNA 混合;
將混合液緩慢注入電穿孔杯;
檢查液面高度與電極接觸良好;
插入儀器電極槽并關閉防護蓋。
按下“PULSE”按鈕;
系統(tǒng)自動充電并釋放脈沖;
實驗完成后屏幕顯示實際放電參數(shù);
等待自動放電完成。
取出電穿孔杯;
立即將細胞加入復蘇培養(yǎng)液中;
室溫靜置 10 分鐘以促進膜修復;
進行后續(xù)培養(yǎng)、篩選或檢測。
模式:指數(shù)衰減波;
電極間距:0.2 cm;
電壓:2.5 kV;
電容:25 μF;
電阻:200 Ω;
緩沖液:10% 甘油;
操作后立即加入 1 mL SOC 培養(yǎng)基復蘇 1 小時;
典型轉(zhuǎn)化效率:10? CFU/μg DNA。
模式:指數(shù)衰減波;
電壓:1.5 kV;
電容:50 μF;
電阻:400 Ω;
緩沖液:1 M 山梨醇;
電擊后復蘇 30 分鐘;
轉(zhuǎn)化率高、存活率穩(wěn)定。
模式:方波;
電極間距:0.4 cm;
電壓:250 V;
脈沖時間:10 ms;
間隔:0.5 s;
脈沖次數(shù):2;
溫度:22℃;
培養(yǎng)基:含血清 DMEM;
轉(zhuǎn)染后細胞存活率 >80%。
模式:方波;
電壓:400 V;
脈沖時間:20 ms;
脈沖次數(shù):3;
緩沖液:0.4 M 甘露醇 + CaCl?;
轉(zhuǎn)染后在黑暗中培養(yǎng) 24 小時;
外源基因表達明顯。
從低電壓逐步增加,直至獲得最高轉(zhuǎn)染效率且細胞存活率仍在安全范圍內(nèi)。
建議初始電壓為推薦值的 80%。
電容決定能量儲存,電阻控制能量釋放速度。
較高電容和電阻組合適用于膜厚細胞;較低組合適用于細菌。
低溫(4℃)可延緩膜修復,提升導入效率;室溫(20℃)利于細胞恢復。
復蘇時間應控制在 5–15 分鐘內(nèi)。
推薦 DNA 濃度 10–50 ng/μL;鹽分殘留會降低放電效率,應徹底透析或乙醇沉淀純化。
適用于哺乳動物細胞。適當增加脈沖次數(shù)可提高導入率,但需注意細胞耐受限度。
每次實驗應記錄以下內(nèi)容:
電壓、電容、電阻或脈沖時間;
樣品種類與編號;
電極間距與杯型號;
實際放電時間與波形;
細胞存活率;
轉(zhuǎn)染效率(通過熒光標記或報告基因檢測)。
結(jié)果分析可采用以下指標:
轉(zhuǎn)染效率(%);
存活率(%);
實驗重復性(標準差或變異系數(shù) CV)。
若變異系數(shù) <10%,說明實驗方案參數(shù)穩(wěn)定可靠。
嚴禁帶電開蓋;
不得在高濕環(huán)境下操作;
放電結(jié)束后等待自動放電指示燈熄滅;
操作者佩戴防靜電手套。
每次實驗后用無離子水清洗電極槽;
禁止使用含氯清潔劑;
每月校驗一次輸出電壓;
每半年進行全面性能檢測;
電容模塊壽命超過 1000 次放電后建議更換。
| 故障 | 原因 | 解決方法 |
|---|---|---|
| 無放電 | 電極接觸不良 | 重新插緊電極 |
| 電弧放電 | 樣品有氣泡 | 重新離心除氣 |
| 波形異常 | 電容損耗 | 更換模塊 |
| 過載報警 | 液體外溢或電極短路 | 清潔后重新測試 |
GenePulser Xcell 采用閉環(huán)反饋控制系統(tǒng),保證每次放電參數(shù)一致性誤差 <1%。
為確保復現(xiàn)性,應:
每批實驗使用相同緩沖液;
控制細胞密度(1×10?/mL);
定期測試放電波形;
保存所有實驗記錄文件。
該系統(tǒng)可存儲多達 99 組實驗方案,便于長期使用與結(jié)果對比。
蛋白導入實驗:通過調(diào)整方波時間與能量,可實現(xiàn)多肽或熒光蛋白導入;
RNA 干擾實驗:短脈沖低電壓模式適合 siRNA;
基因編輯實驗:與 CRISPR/Cas9 技術結(jié)合,提高編輯效率;
疫苗研究:用于細胞內(nèi)抗原表達與免疫應答研究。
GenePulser Xcell 電穿孔儀結(jié)構堅固、設計科學、參數(shù)穩(wěn)定。所有設備出廠均經(jīng)過嚴格電氣與性能檢測。
質(zhì)保3年只換不修,廠家長沙實了個驗儀器制造有限公司。
該公司承諾在質(zhì)保期內(nèi)若設備出現(xiàn)任何非人為性能故障,將提供整機更換服務,無需返修等待,確保科研項目順利進行。所有維護記錄可通過廠方技術支持系統(tǒng)查詢。
伯樂 GenePulser Xcell 電穿孔儀以其高精度控制、穩(wěn)定波形輸出與廣泛適用性,成為現(xiàn)代分子生物學實驗室中不可或缺的核心設備。通過科學的實驗方案設計與合理的參數(shù)優(yōu)化,科研人員能夠?qū)崿F(xiàn):
高效率的基因轉(zhuǎn)染;
穩(wěn)定的實驗復現(xiàn)性;
低細胞損傷率;
優(yōu)秀的長期運行穩(wěn)定性。
在嚴謹?shù)膶嶒灄l件與標準化操作下,GenePulser Xcell 不僅能滿足基礎研究需求,更適用于高標準的工業(yè)化生產(chǎn)與臨床研究項目,為生命科學實驗提供可靠的技術支撐。
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