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一、概述

伯樂（Bio-Rad）電穿孔儀165-2661是一款集精確控制、高效能量釋放與智能化管理于一體的高性能電轉化設備，主要用于DNA、RNA或蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的導入實驗。該儀器可產(chǎn)生受控高壓脈沖，瞬間改變細胞膜的電勢狀態(tài)，形成可逆性納米孔洞，從而實現(xiàn)分子跨膜運輸。

165-2661型號在電壓調(diào)節(jié)精度、電容釋放穩(wěn)定性、時間常數(shù)檢測及安全防護方面均較前代產(chǎn)品有顯著提升。其操作系統(tǒng)設計簡潔，具備自動檢測、數(shù)據(jù)記錄、參數(shù)存儲及錯誤報警功能，適用于細菌、酵母、哺乳動物細胞和植物原生質(zhì)體等多種體系。

本教程旨在詳細介紹伯樂165-2661的操作步驟、實驗流程、參數(shù)設置、樣品準備及注意事項，幫助科研人員掌握標準化實驗操作流程，實現(xiàn)高效、安全、可重復的實驗結果。

二、儀器組成與功能概述

165-2661電穿孔儀主要由以下部分構成：

1. 主機系統(tǒng)：控制電壓、電容及時間常數(shù)的核心模塊。

2. 高壓儲能與放電系統(tǒng)：用于能量積累與脈沖釋放。

3. 電極輸出接口：連接電轉杯并傳導能量。

4. 顯示與控制面板：設置實驗參數(shù)與實時顯示狀態(tài)。

5. 安全防護模塊：包括電弧檢測、安全蓋感應與過壓保護。

6. 散熱系統(tǒng)：維持內(nèi)部溫度穩(wěn)定。

儀器結構緊湊，參數(shù)調(diào)節(jié)采用數(shù)字化控制，所有關鍵數(shù)據(jù)均通過LCD屏實時顯示，確保操作可視化與可追溯。

三、實驗前準備

1. 環(huán)境要求

• 溫度范圍：20–25°C；

• 相對濕度：≤60%；

• 電源電壓：AC 220 V ±10%；

• 接地電阻：≤1 Ω；

• 環(huán)境應無強磁場、導電塵埃及振動源。

2. 儀器檢查

在開機前，操作人員應完成以下檢查：

1. 確認電源線完好且接地可靠；

2. 檢查電極接口及電轉杯是否干燥、清潔；

3. 確認安全蓋感應裝置正常；

4. 檢查面板是否顯示“Ready”；

5. 確保電源插座不與其他高功率設備共用。

3. 樣品準備

以大腸桿菌為例，樣品制備過程如下：

1. 接種菌株于LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至OD???≈0.4；

2. 離心（4000 rpm，5分鐘），去上清；

3. 使用冰冷10%甘油溶液洗滌3次，去除培養(yǎng)基鹽分；

4. 將菌體重懸于10%甘油中，濃度約1×10? cells/mL；

5. 加入外源質(zhì)粒DNA（1–2 μg）；

6. 冰上預冷5分鐘備用。

對于哺乳動物細胞，可采用無血清緩沖液（如Opti-MEM）重懸，并保持低溫操作。

四、開機與自檢流程

1. 打開電源開關，儀器進入啟動自檢狀態(tài)；

2. 系統(tǒng)檢測高壓模塊、電容組、安全蓋感應器及電極連接狀態(tài)；

3. 若顯示“Ready to Pulse”，表示可進入操作階段；

4. 若出現(xiàn)“Check System”提示，應檢查安全蓋或電極接觸是否異常。

自檢通過后，系統(tǒng)自動進入主界面，顯示默認電壓、電容與時間常數(shù)值。

五、實驗參數(shù)設置

1. 電壓設置

按下“VOLTAGE”鍵，使用方向鍵輸入所需電壓。

• 電壓范圍：0.2–2.5 kV；

• 分辨率：0.01 kV；

• 建議設置：

• 細菌體系：2.0–2.5 kV；

• 酵母體系：1.0–1.5 kV；

• 哺乳細胞：0.25–0.8 kV；

• 植物原生質(zhì)體：0.8–1.0 kV。

2. 電容設置

按下“CAP”鍵選擇所需電容檔位（25–3300 μF）。

• 小電容：用于細菌或短脈沖放電；

• 中等電容：用于真核細胞或中能量體系；

• 大電容：用于植物細胞或大體積電擊實驗。

3. 模式選擇

• 單脈沖模式（Single Pulse）：適合細菌與酵母；

• 多脈沖模式（Multi Pulse）：適合哺乳動物細胞，增強DNA導入效率；

• 程序模式（Program Mode）：可調(diào)用已保存參數(shù)組。

4. 確認與保存

設定完成后，按“ENTER”鍵確認，屏幕顯示設定參數(shù)；
如需保存當前方案，按“SAVE”，系統(tǒng)自動編號并記錄。

六、樣品加載與電轉操作

1. 樣品裝入電轉杯

1. 取預冷電轉杯（0.2 cm間隙）置于冰上；

2. 吸取40–50 μL樣品混合液加入電轉杯；

3. 輕拍電轉杯底部以排除氣泡；

4. 將電轉杯插入儀器電極槽中，確保接觸良好；

5. 關閉安全蓋。

2. 放電執(zhí)行

1. 按下“PULSE”鍵啟動放電；

2. 儀器自動釋放儲能電量并顯示放電狀態(tài)；

3. 屏幕實時顯示：

• 實際電壓值（V）；

• 時間常數(shù)τ（ms）；

• 電弧檢測狀態(tài)（OK或ARC）；

4. 放電完成后，系統(tǒng)發(fā)出提示音并顯示“Pulse Complete”。

3. 放電時間與波形判斷

• 正常放電：時間常數(shù)為4–8 ms，顯示“OK”；

• 異常電弧：顯示“ARC DETECTED”，需重新制備樣品；

• 電流中斷：可能因安全蓋未閉合或電極接觸不良，應重新檢測。

七、放電后處理

1. 取出電轉杯并立即置于冰上冷卻2分鐘；

2. 向電轉杯中加入1 mL冰冷SOC復蘇培養(yǎng)基；

3. 將混合液轉移至無菌離心管中；

4. 37°C培養(yǎng)1小時以恢復細胞；

5. 涂布含抗性標記的培養(yǎng)基平板并培養(yǎng)12–16小時；

6. 觀察轉化菌落或進行后續(xù)篩選。

哺乳細胞體系需在無血清條件下復蘇4小時后更換完全培養(yǎng)基。

八、操作注意事項

1. 防止電弧放電

• 樣品中不得含鹽；

• 電轉杯內(nèi)無氣泡；

• 電極表面保持干燥。

2. 控制溫度

• 所有樣品與電轉杯需預冷；

• 放電后立即冰浴處理。

3. 電壓與電容匹配

• 電壓過高或電容過大會導致細胞膜不可逆損傷；

• 建議通過小范圍預實驗優(yōu)化。

4. 安全防護

• 放電過程中不得觸碰儀器；

• 儀器必須可靠接地；

• 若設備出現(xiàn)異響或冒煙，應立即斷電。

5. 多次實驗間隔

• 每次放電間隔≥30秒，以防電容過熱。

九、數(shù)據(jù)讀取與記錄

165-2661可實時記錄實驗數(shù)據(jù)，包括：

• 放電電壓；

• 電容值；

• 時間常數(shù)；

• 電弧檢測狀態(tài)；

• 實際放電曲線。

操作步驟：

1. 按下“VIEW”鍵查看上一次放電記錄；

2. 可通過USB接口導出數(shù)據(jù)文件（TXT或CSV格式）；

3. 建議建立實驗記錄表，包括樣品編號、參數(shù)組合及結果分析。

標準記錄示例：

十、清潔與維護

1. 實驗結束后

1. 關閉電源，待風扇停止后拔出電源插頭；

2. 用無水乙醇或去離子水清潔電極槽；

3. 擦干儀器表面，保持通風干燥；

4. 電轉杯清洗后晾干備用。

2. 定期維護

十一、常見問題與解決方案

十二、實驗優(yōu)化建議

1. 細胞狀態(tài)

• 細胞應處于生長對數(shù)期，過度培養(yǎng)會降低電穿孔效率。

2. DNA純度

• 使用高純度質(zhì)粒DNA，A???/A???應在1.8–2.0之間。

3. 緩沖液導電性

• 理想導電率≤10 μS/cm，過高會導致電弧。

4. 能量調(diào)控

• 通過調(diào)節(jié)電壓或電容微調(diào)能量密度，平衡轉化效率與細胞存活率。

5. 重復性驗證

• 同一參數(shù)下進行3次獨立放電，若時間常數(shù)偏差<0.2 ms，則條件穩(wěn)定。

十三、安全操作規(guī)范

1. 設備運行期間禁止打開安全蓋或接觸電極；

2. 若儀器報警，應立即停止操作并關閉電源；

3. 實驗室應配備干粉滅火器、防電擊絕緣墊與急救設施；

4. 操作人員須接受高壓設備培訓；

5. 定期進行安全檢查與電氣檢測。

十四、結果評估

電穿孔成功的關鍵指標包括：

• 細胞存活率高于80%；

• 無電弧放電；

• 轉化效率達到預期標準（如>10? CFU/μg DNA）；

• 時間常數(shù)穩(wěn)定在理論值±0.2 ms范圍內(nèi)。

若結果偏差明顯，應重新評估緩沖液成分、電極清潔度及能量參數(shù)。